灵芝三萜的提取分离及总三萜的含量测定

• 灵芝是一种名贵的药用真菌{体育外围主词}{体育外围主词}，属于担子菌纲多孔菌科灵芝属真菌赤芝和紫芝的总称，始载于 ? 神农本草经 ?，具有补中益气、滋阴强壮、扶正固本、延年益寿等功效{体育外围主词}。

  灵芝主要成分为多糖类和三萜类{体育外围主词}。三萜类成分复杂，曾祥丽等 [1] 报道灵芝含有 122 种三萜类成分，其中最主要是灵芝酸 37 种。林志彬等研究认为灵芝三萜具有抗 HIV-1 及 HIV-1 蛋白酶活性{体育外围主词}、保肝、抗肿瘤和抗艾滋病毒等药理活性 .本文对灵芝三萜的提取分离及总三萜的含量测定作以下报道.

  1 仪器、试剂

  旋转蒸发仪（日本生产{体育外围主词}，EYELA ROTORY EVAPOPATOR N-1000）；GB204电子天平（瑞典）；751型紫外-可见分光光度计（上海分析仪器厂）；硅胶G（青岛高能达化工有限公司）；薄层层析硅胶板HSGF254（烟台江友硅胶开发有限公司）、氯仿、石油醚{体育外围主词}、乙酸乙酯、甲醇等试剂均为分析纯，熊果酸对照品（中国药品生物制品检定所）{体育外围主词}。

  2 方法

  2.1 灵芝三萜的提取方法 灵芝三萜属于脂溶性成分，通常用有机溶剂进行提取。本实验对提取溶剂、提取次数、时间及其用量 4 个试验因素，每个因素设3 个水平，以熊果酸为对照品测得的总三萜含量作为考察指标，选用 L9（34）正交试验表安排试验。

  各因素对灵芝总三萜提取工艺影响大小为：C>B >A>D，经各方面综合考虑后，最终选出最佳提取工艺为：5倍量95%乙醇回流提取3次，每次1.5 h{体育外围主词}。

  2.2 灵芝干浸膏制备方法

  称取干燥灵芝粗粉 4 000 g，加入 5 倍量的 95% 乙醇回流提取 3 次{体育外围主词}，每次 2 h，过滤{体育外围主词}，滤液水?。?0~60 ℃）蒸干得浸膏 345.26 g，加水使充分溶解，用等量的氯仿萃取 3 次，合并氯仿层，减压回收至适量，水?。?0~60 ℃）蒸干得浸膏82.86 g{体育外围主词}。

  2.3 灵芝三萜的分离方法 

  将上面所得浸膏用适量乙酸乙酯充分溶解，挥至少量 , 用 2 倍量硅胶拌样，30 倍量硅胶装柱，先用石油醚 - 乙酸乙酯（9：1）洗脱，洗脱液每 100 mL 收一次{体育外围主词}，至洗脱液近无色（在硅胶 HSGF 254 板上点样无斑点显示）时，再用石油醚 - 乙酸乙酯（7：3）洗脱{体育外围主词}，合并第 49 至 73 流份{体育外围主词}，减压回收至少量，自然挥干，得粗晶 4.139 3 g，用少量乙酸乙酯溶解，2 倍量硅胶拌样{体育外围主词}，100 倍量硅胶装柱，用石油醚 - 乙酸乙酯（7：3）洗脱{体育外围主词}，洗脱液每 30 mL 收集一次，合并第 9~33 和 34~44 流份，分别减压回收至适量，用甲醇反复重结晶，可得白色针

  状晶体Ⅰ (1.862 4 g) 和白色针状晶体Ⅱ (0.546 8 g)。

  3 灵芝总三萜的含量测定

  3.1 标准曲线的制备 取熊果酸对照品 1.15 mg，溶于 10.00 mL 乙酸乙酯中，混合均匀得对照品溶液。分别吸取 0.00{体育外围主词}、0.10、0.20、0.40、0.60{体育外围主词}、0.801.00

  和 1.20 mL 对照品溶液{体育外围主词}，在 100℃水浴上蒸干后加入0.40 mL 5％香草醛一冰乙酸溶液和 1.00 mL 高氯酸，于 60 ℃水浴中加热 15 min 后移入冰水浴中，再加入5.00 mL 冰乙酸，摇匀后置于室温。15 min 后，用紫外 -可见分光光度计在 548.1 nm 波长下测定其吸光度。

  据测定结果绘制标准曲线。对照品重量在 0~0.14 mg 范围内与吸光度值呈良好的线性关系，其线性回归方程为 Y=0.140 8X+0.002 6{体育外围主词}，相关系数 r=0.999 1。

  3.2 直接光度法测定 取灵芝样品 5.00~10.00 mg，溶于 10.00 mL 乙酸乙酯中。分别吸取定体积的该溶液，在 100 ℃水浴上蒸干后加入 0.40 mL 5％香草醛一冰乙酸溶液和 1.00 mL 高氯酸{体育外围主词}，于 60 ℃水浴加热15 min 后移入冰水浴中，再加入 5.00 mL 冰乙酸，摇匀后置于室温{体育外围主词}。15 min 后用紫外 - 可见分光光度计在548.1 nm 波长下测定样品溶液的吸光度。结果表明{体育外围主词}，该品种灵芝中总三萜含量为 9.07%。

  4 结论

  灵芝的药用成分，主要是其中含有的多糖和三萜成分{体育外围主词}，而三萜化合物分子功能团较多{体育外围主词}，结构复杂多样且不稳定{体育外围主词}，容易随温度的变化而改变{体育外围主词}，所以在提取时温度的控制是关键。灵芝三萜具有广泛的药理活性，它的提取分离已基本上完成{体育外围主词}，但是，对于具体灵芝三萜的结构确定及其药理作用的研究有待下一步完成。