灵芝破壁孢子粉对 LEWIS 荷瘤小鼠细胞免疫干预作用

• 灵芝含多糖、核苷类、生物碱、三萜类化合物等, 具有免疫调节、抗肿瘤等作用。本实验主要是通过 灵芝破壁孢子粉对 LEWIS 荷瘤小鼠进行干预,研究 在细胞免疫方面扶正中药抗肿瘤作用机制。

   1　材料与方法 

  1. 1　动物与分组 选用清洁级健康 4 月龄 Balb c 近交系小鼠 180 只,购自北京维通利华实验动物技术有限公司(动物 合格证号为: SCXK(京) 2002-0003) ,体重 18g～ 22g, 雌雄各半。 按体重将小鼠随机分为 6组: 正常组、模型空白组、中药组、西药组、中药+西药 1 组、中药+西药 2 组。

   1. 2　荷瘤 瘤株选用 LEWIS 瘤株(购自中国医科大学免疫 学教研室)。荷瘤方法: 将 LEWIS 瘤株腹腔接种于 Balb c 小鼠,1周后无菌抽取腹水,即制得 LEWIS 腹 水癌细胞。使用生理盐水将细胞浓度调至 2×107 ml,0. 2ml 只皮下接种至小鼠左腹股沟处。

   1. 3　药物与给药方法 造模同时给药。中药组给予灵芝破壁孢子粉 2g kg( 霍玉书教授提供) ,灌胃,每日 1 次; 西药组给予顺铂 1mg kg(齐鲁制药厂,批号: 0302001) ,腹腔注 射,每日 1次; 中药+西药 1 组给予灵芝破壁孢子粉 2g kg d,灌胃,每日 1 次,同时给予顺铂 1mg kg d,腹 腔注射,每日 1次; 中药+西药 2 组给予灵芝破壁孢 子粉 4g kg d,灌胃,每日 1次,同时给予顺铂 1mg kg d ,腹腔注射,每日 1 次。正常组与?？兆槊咳找缘?量生理盐水灌胃。 

  1. 4　试剂 

  淋巴细胞分离液(上海试剂二厂) ,小鼠 CD4( FITC)、CD8( PE)荧光标记抗体购自美国 Pharmingen 公司。

   1. 5　检测指标

   1. 5. 1　抑瘤率　

  灌胃 15d 后处死小鼠,摘除局 部肿瘤称重,与?？兆橹琢龃笮”冉虾蠹扑阋至雎?。 抑瘤率公式为: 抑瘤率=肿瘤模型空白对照组瘤重 -实验用药组肿瘤重量 肿瘤模型空白对照组瘤重 ×100%。

   1. 5. 2　淋巴细胞转化率　实验前 3d,小鼠肌注 植物血凝素( PHA) 0. 1ml 只(相当于 10mg kg) ,每日 1 次,连注 3d。实验时将小鼠断尾取血 1 滴,约高粱 米粒大小,置于玻片,推成片状。自然干燥后,姬瑞 氏染色3min～ 7min,再用生理盐水冲洗,用滤纸将标 本干燥后,镜检。淋巴细胞转化率的计算公式为: 淋 巴细胞转化率=转化淋巴细胞 (转化淋巴细胞+未 转化淋巴细胞)×100%。

   1. 5. 3　吞噬细胞吞噬率　实验前 24h 将 5%可 溶性淀粉注入小鼠腹腔内,1ml 只。取材前 1h 向小 鼠腹腔注射 1%鸡红细胞( CRBC) ,1ml 只。1h 后每 只小鼠腹腔注射 2ml 生理盐水,轻轻揉小鼠腹部,断 颈处死,在腹部剪一小口,用滴管抽取腹腔液 1 滴, 水平涂片,37℃温箱孵育 30min,用生理盐水轻轻冲 洗载玻片,自然晾干。姬瑞氏染色 5min,取出后生 理盐水冲洗 1 次,自然晾干,100 倍油镜下观察。镜 下数 100个淋巴细胞,按吞噬细胞吞噬鸡红细胞的 情况计算吞噬细胞吞噬率。计算公式为: 吞噬百分 率=100 个巨噬细胞中吞噬 CRBC 的巨噬细胞数 100( 巨噬细胞数)×100%。 

  1. 5. 4　T 细胞亚群流式检测　摘除小鼠眼球, 将小鼠头置于清水中,使血液流净。无菌取出小鼠 脾脏,使用 5ml 注射器抽取 2ml PBS ,将注射器针头 插入脾脏内,注入磷酸缓冲液( PBS) ,使用弯镊子按 同一方向积压脾脏,使脾细胞从针孔涌出,直至脾脏 被膜变成灰白。使用注射器反复抽取脾细胞悬液, 混匀。用 100目筛网过滤细胞悬液。从试管底部缓 缓加入淋巴细胞分离液(比重: 1. 089) ,离心 2500r 20min。离心后可见淋巴细胞聚集在中间层,使用吸 管缓缓吸出中间层的淋巴细胞。PBS 清洗细胞, 1000r 10min,连续 3 次。将细胞调成 2×106 ml 细胞 悬液。待测管中加入 0. 5ml 的细胞悬液,以及荧光标记的抗体CD4 、CD8 各 10ul。避光,4℃,孵育 20min ～ 40min。清洗,1000r 4min 2次,上柱检测。

  1. 6　统计学处理 

  用SPSS 11. 0 统计软件进行处理,多样本均数 比较采用 one-way ANOVA(方差分析) ,多样本均数 间两两比较采用 q 检验,结果以均数±标准差( x ± s) 表示,P <0. 05被认为有显著性差异。 

  3　讨论 

  《神农本草经》称灵芝“味甘温,主耳聋,利关节, 保神益精,坚筋骨,好颜色,久服轻身不老延年”。现 代研究证实,灵芝对于机体免疫功能具有良好的调 节作用,灵芝及其多糖还具有抗肿瘤作用[1 ] 。

  孢子是灵芝的一种繁殖结构,具有坚韧的外壁,需破壁后 才可为人所用。有研究表明,灵芝孢子粉在破壁后 对小鼠的免疫功能作用更大[2] 。我们选用灵芝破壁孢子粉以观察其对荷瘤小鼠免疫功能的调节作用, 并与目前抗肿瘤常用、有效的西药顺铂进行对照,该 药毒副作用比较明显。如果灵芝破壁孢子粉具有相 似的抗肿瘤作用,而又很少毒副作用,无疑会给中医 药抗肿瘤药物的利用开拓一个新的途径。 扶正祛邪,是中医治疗癌症的基本治则?！胺?正”表现为提高机体自身免疫力,抑制癌细胞的增 长、转移和复发,从而实现带瘤生存,延长生存期,提 高生存质量。灵芝及其多糖抗肿瘤、灵芝孢子粉的 免疫调节作用,主要表现在增强细胞的免疫功能,促 进细胞因子的产生以及提高体液免疫反应等方 面[3 ] 。

  本研究发现,单纯灵芝破壁孢子粉可提高荷 见对策为治疗原发病,防止肝损害,减少炎症,抑制 星状细胞活化增殖,促 ECM 降解等。临床上抗肝纤 维化的药物主要有αγ -IFN、细胞?；だ嘁┪?如水 飞蓟素、马洛替酯、VitE)等。但临床作用不确切,故 尚无合适的抗肝纤维化西药。中医药在干预肝纤维 化方面已显示出较明显的优势,中药复方多成分、多 环节、多层次、多靶点的药理学作用,可能是其优势 的重要特点之一?？凳峡瓜丝帕Ｖ饕晒臧?、鳖甲、 郁金、丹参、黄芪、西洋参等 16 味中药组成。方中黄 芪、西洋参、龟板、鳖甲佐以郁金、柴胡、佛手、丹参、 丹皮等补脏气令气行血亦行,补阴液则津足而利血 行,且软坚散结; 败酱草、茜草等凉血、活血化瘀,能 宣通瘀塞络道防止动血; 佐以清气分之毒、搜血分之 邪的栀子根、茵陈、蛇舌草等,共奏扶正祛邪、化瘀通 滞之功。几十年来用于临床治疗肝纤维化患者数百 例,取得了良好的抗肝纤维化效果。并且在前期进 行的临床研究中,发现康氏抗纤颗粒具有明显的抗 炎症反应及逆转肝纤维化的作用[3 ]  本实验表明,康氏抗纤颗?？梢越档脱骞缺?转氨酶和谷草转氨酶,提高血清白蛋白的含量,降低 血清透明质酸及肝组织羟脯氨酸的含量,减少肝纤 维化面积,降低肝组织 α -SMA 的表达,表现出明显 的抗纤维化作用。

  分析康氏抗纤颗?？瓜宋饔?的机理可能包括以下几个方面: ( 1)?；じ蜗赴? 血 清转氨酶的变化是反映肝细胞损害的敏感指标,血 清白蛋白是由肝细胞合成,其含量变化与有功能的 肝细胞数量成正比。实验中康氏抗纤颗粒能显著降 低血清 ALT、AST 和升高 Alb,与模型组相比有显著 性差异,说明康氏抗纤颗粒有良好的?；じ蜗赴?用。炎症和肝细胞损伤是肝纤维化的启动因素,因此?；は赴?防止肝损伤,必然有助于阻断肝纤维化 的发生。( 2)调节胶原代谢: 羟脯氨酸是胶原蛋白特 有的氨基酸,肝脏羟脯氨酸的含量可反应肝脏胶原 蛋白合成的量。羟脯氨酸是胶原代谢的重要产物, 胶原蛋白代谢异常,一定会反映在羟脯氨酸的变化 上?？凳峡瓜丝帕Ｗ槟芟灾档透巫橹歉彼岬?含量,与模型组相比有显著性差异。血清透明质酸 是人体结缔组织基质的主要成分,由间质细胞合成, 主要与肝窦内皮细胞受体结合而被摄取降解。故肝 纤维化、肝硬化时升高的主要原因是肝内细胞合成 增多,摄取降解的能力下降。

  实验表明,康氏抗纤颗 ?？梢韵灾档脱逯械耐该髦?酸含量( P < 0. 01)。以上表明,康氏抗纤颗?？梢酝ü跎俑卧?胶原的合成达到阻断肝纤维化的效果。( 3)减少活 化的肝星状细胞: 激活的肝星状细胞表达α -SMA,因 此,α -SMA 被认为是肝星状细胞活化的标志。激活 的肝星状细胞转化为肌成纤维母细胞并分泌大量细 胞外基质成分,沉积于肝脏形成肝纤维化。实验表 明,康氏抗纤颗粒能显著降低 α -SMA 的表达,与模 型组相比有显著性差异,表明康氏抗纤颗?？垢蜗?维化作用机制与减少活化的肝星状细胞数量有关。