灵芝中性三萜类成分的抗肿瘤作用

• 灵芝( Ganoderma lucidum)在我国已有悠久 的应用历史,临床上可用于多种疾病的治疗。近 几十年对这种古老的药用真菌的化学、药理、临 床等领域进行了大量的研究,发现可用于多种疾 病包括肿瘤、糖尿病{体育外围主词}、高血压等的治疗,并具有较 好的疗效{体育外围主词}。其中对肿瘤的治疗引起了人们的高 度关注,并开发了大量的辅助抑制肿瘤的保健产 品如绿谷的双灵固本散,中科灵芝等。在灵芝抗 肿瘤的作用机制方面,也进行了大量的研究,以 寻找其中的抗肿瘤的活性成分以及通过何种途 径达到抗肿瘤的效果。 自 1982 年 KUBOTA[1] 首 次从 灵 芝(G. lucidum)子实体中分离得到三萜类化合物灵芝 酸 A 和灵芝酸 B 后,各国都展开了对灵芝三萜类 化合物的研究,目前已先后从灵芝的子实体{体育外围主词}、菌 丝体和孢子粉中分离到 140 多种三萜类化合物  {体育外围主词}。灵芝三萜抗肿瘤作用的研究一直是灵芝 药理研究的重点,灵芝中三萜类成分可以通过抑 制蛋白激酶 C 活性而抑制人类肝脏肿瘤细胞生 长 [ 3 ] 。TO TH[ 4 ] 等从灵芝菌丝体中提取得到 6 个细胞毒活性的三萜类化合物 ganoderic acid U 、 V 、W 、X 、Y 、和 Z,并发现它们能明显抑制小鼠肝 肉瘤( HTC)细胞的增殖{体育外围主词}。近几年也不断发现灵 芝类三萜具有体外抗肿瘤作用[ 5～ 7 ] 。由于三萜化 合物种类繁多,分离纯化十分困难,大多数三萜仅仅停留于细胞活性的筛选,限制了灵芝三萜类 化合物的进一步研究和开发{体育外围主词}。笔者从灵芝中分 离得到灵芝抗肿瘤的有效成份—灵芝中性三萜 部分,并对其抑制肿瘤细胞及其诱导肿瘤细胞凋 亡进行了初步研究,为灵芝三萜的抗肿瘤应用提 供依据。

   1　材料与方法 

  1. 1 材料 

  1. 1. 1 灵芝材料 　　

  灵芝( G. lucidum)原料购自浙江龙泉灵芝 栽培基地。

   1. 1. 2 细胞株SW620 细胞株(人肠癌细胞株) ,L1210 细胞 株(小鼠淋巴癌细胞株) ,K562 细胞株(人淋巴癌 细胞株) ,MCF7 细胞株(人乳腺癌细胞株)均购 自美国国家菌种保藏中心( A TCC)。

   1. 1. 3 主要试剂RPMI1640 培养基、0. 25%胰蛋白酶和胎牛 血清(FBS )购自 Gibco 公司; 青霉素和链霉素 购自 Amresco 公司,A lamar Blue A ssay kit 购自 Biosource 公司,三帖的标准品为上海中医药大学吴弢教授所赠{体育外围主词}。

  1. 2 方法

   1. 2. 1 RPMI 1640 培养基的配制

  　培养基中加入灭菌超纯水配制,用前每升中 加入 NaHCO3 2 g,10%灭活的胎牛血清( Gibco 公司) ,青霉素 30 μ g/mL ,链霉素 l00 μ g/mL, 用 1 mol/L 的 NaOH 调节pH 7. 2,过0 . 22 μ mol/L 滤膜后,分装 4 ℃保存。

   1. 2. 2 三萜类组分的提取和分离纯化 　　

  灵芝子实体粗粉 2 kg,20 L 的 95%乙醇室 温浸提 12 h ,重复 3 次,提取液(总提物)减压浓 缩得到浸膏,复溶于 500 mL 水中,后用等体积氯 仿萃取 3 次,合并氯仿层,减压浓缩到原体积的 三分之一,用 100 mL 饱和 NaHCO3 溶液萃取 3 次,取氯仿层部分减压浓缩,直至得到棕色浸膏, 为中性成分,命名为 NTF ; 水相部分加浓盐酸调 pH 值到 2～ 3,重复上述方法用氯仿萃取,得到棕 色浸膏为酸性成分,命名为 ATF。NTF 用 200～ 300 目的硅胶柱层析分离,洗脱剂为石油醚-丙 酮,梯度洗脱,其中石油醚-丙酮( 10 ∶1)洗脱组 份再用反相硅胶 MCI 柱层析分离,80 %甲醇洗 脱得到灵芝的中性三萜部分。

   1. 2. 3 N TF 和 ATF 的 HPLC 分析 　

  HPLC 色谱条件: Waters 高效液相色谱系统 ( 2695 HPLC pump ,In-line degasser,2487 Dualλ absorbance detector); 色谱柱为 C18 柱( YMCpack ODS AQ,46 mm×300 mm,5 μ m); 流动相 ( A 为甲醇∶冰醋酸=99 ∶1; B 为超纯水∶冰醋 酸=99 ∶1; A∶B =11 ∶9) , 梯度洗脱; 流速为 1 mL/min ;进 样 量: 10 μ L;紫 外 检 测 波 长 254 nm。将 1 mg 样品溶于 1 mL 甲醇中,20 μ m 滤膜过滤后进行检测{体育外围主词}{体育外围主词}。

   1. 2. 4 悬浮肿瘤细胞株的培养( L1210 和 K562)

  　　用 RPMI1640 完全培养基在 37 ℃{体育外围主词}、5 %的 CO2条件下传代培养,混悬液 300 g 离心3 min后 收集细胞,再用 RPMI1640 培养基将细胞调成所需浓度{体育外围主词}。

   1. 2. 5 贴 壁 肿瘤 细 胞株 的 培 养( SW620 和 MCF7) 　　

  用 RPMI1640 完全培养基在 37 ℃{体育外围主词}、5 %的 CO2条件下传代培养, 再用 0. 25%胰酶或 5% EDTA 溶液消化,后续步骤同 1 . 2. 4 。

   1. 2. 6 抑制肿瘤细胞增殖实验 　

  将 199 μ L 肿瘤细胞悬浮液( 1 ×104 个/mL) 和 1 μ L 的药物样品分别加入 96 孔板中, 以 DMSO 为阴性对照, 5-Fu( 20 μ g/mL)为阳性对 照,每个样品设 3 个重复,在 37 ℃、5 %的 CO2条 件下培养 3 d 后加入 20 μ L Alamar Blue 试剂, 变色后用酶联免疫检测仪分别测定 570 nm 和 600 nm 处的吸光度,然后根据 Alamar Blue 试剂 盒提供的公式计算样品对细胞增殖的影响。 肿瘤细胞抑制率(%)={ 1 [ 117216 ×A570 ( sample)-80586×A600( sample) ] /[ 117216 ×A570 ( control)-80586 ×A600 ( control) ]}×100% 

  2　结果与分析 

  2. 1 NTF 和 ATF 的 HPLC图谱以及活性比较 　　

  从 HPLC 图谱中可以看出灵芝中性三萜与 灵芝酸性三萜部分的峰基本上没有重叠,灵芝酸 性三萜部分的极性较大,出峰时间比中性部分要早 ,中性三萜有 8 个峰,有两个峰分别与标 准品灵芝酮二醇和丹芝醇 A 对应。

  　灵芝总提物、灵芝酸性三萜和中性三萜在同 样的浓度( 10 μ g/mL)时,对肿瘤细胞 K562 的抑 制作用不同,中性三萜对 K562 细胞的抑制率大 于 50%,而灵芝酸性三萜和总提物的抑制率仅 10%～ 20%左右,因此中性三萜的抑制作用要高 于酸性三萜和总提物。

   2. 2 灵芝中性三萜对不同肿瘤细胞增殖的抑制作用 　

  在上面实验的基础上,笔者用中性三萜对不 同肿瘤细胞株进行抑制实验,结果如图 4 所示, 表明中性三萜对供试细胞株都具有很好的抑制 效果,其中抑制效果最为明显的就是小鼠淋巴癌 L1210 细胞株,在处理浓度 2 μ g /mL 时抑制率 就已经达到60 %; 其次为人淋巴癌 K562 细胞株, 处理浓度为 10 μ g /mL 时,抑制率就达到 53%; 然后是人肠癌 SW620 细胞株, 在处理浓度达到 50 μ g /mL 时,抑制率达到 55%; 最后是人乳腺 癌MCF7 细胞株,在和 10 μ g /mL ,没有明显的抑制效果,在 50 μ g/mL 时达到 50%。

  2. 3 灵芝三萜对 SW620 细胞处理后细胞形态的 变化 　　正常状态的 SW620 细胞为梭状,形态饱满 (图 5A) ,经过 10 μ g/mL 中性三萜处理 24 h 后, 有的细胞开始出现明显凋亡,可以看到清晰的凋 亡小体{体育外围主词}。

  3　讨论 　　

  笔者的研究发现,相对于灵芝总提取物或酸 性部分,灵芝三萜的中性部分具有更好的抑制肿 瘤细胞生长并诱导肿瘤细胞凋亡的作用。由于 目前分离纯化得到纯的灵芝三萜大多仅为几到 几十毫克,初步活性筛选后就没有样品进行进一 步研究,更无法进行动物药理试验{体育外围主词}。笔者从灵芝 中得到可诱导细胞凋亡的灵芝中性三萜,可进行 大量制备,为灵芝抗肿瘤药物的研发建立基础。 笔者经过筛选得到了能够诱导肿瘤细胞凋 亡的灵芝中性三萜有效部位,诱导肿瘤细胞凋 亡,Lin 等[ 5 ] 从赤芝子实体中分离到 2 个三萜类 化合物灵芝醛 A 和双氢灵芝醛 A ,体外实验表明 两者有较强的抑瘤活性,以灵芝醛 A 作用最强。 Li 等将 ganoderic acid X 作用于人肝肿瘤细胞 HuH-7 后,发现能抑制拓扑异构酶活性,从而抑 制 DNA 的合成,诱导细胞凋亡。由此可以得出结论,即灵芝三萜是一种有效的肿瘤细胞凋亡诱 导剂,能够通过引发肿瘤细胞凋亡达到治疗肿瘤 的目的,因此随着研究的不断深入,将灵芝三萜 组分作为新型的抗癌药物进行开发必将具有无 限广阔的市场前景。