破壁与不破壁灵芝孢子粉多糖的分析

• 灵芝孢子粉以其具有抗肿瘤、调节人体免疫功能等功效正风靡全国,乃至海外。一般认为灵芝孢子粉的抗肿瘤功效主要是因为孢子粉中多糖的作用。目前对灵芝孢子粉的成分分析大多是针对其中的氨基酸、脂肪酸、萜类、核苷类等化合物的研究[3, 4 ] ,对灵芝孢子粉多糖只局限于对多糖总量的提取和测定。林树钱等比较了草栽和段木栽灵芝多糖肽的性质和量。 而对灵芝孢子粉多糖的组成及相对分子质量等性质的研究未见报道。 本实验采用气 相色 谱 -质 谱 ( GC-M S )、 高效 液 相色 谱( HPLC)、凝胶渗透色谱 ( GPC)等手段对灵芝孢子粉多糖的组成{体育外围主词}、相对分子质量及其分布等进行了研究,并比较了破壁灵芝孢子粉和不破壁灵芝孢子粉 多糖的异同,对探讨灵芝孢子粉多糖的药理作用,以 及灵芝孢子粉的进一步开发利用具有重要的意义。

  1 实验部分

  1. 1 仪器与试剂

  1. 1. 1 仪器:  Agilent 1100高效液相色谱仪,美国安捷伦公司; Agilent 6890GC / 5973M S 气相色谱 / 质谱联用仪,美国安捷伦公司; 721N 型分光光度计, 上海分析仪器厂。

  1. 1. 2 试 剂: 乙 腈, M erck 公 司, HPLC 级;

  K H2 PO4、 H3 PO4、硫酸、盐酸羟胺{体育外围主词}、吡啶、醋酸酐等试剂, AR级; 试验用 Millipo re超纯水{体育外围主词}。

  1. 2 灵芝孢子粉多糖的提取: 分别取 100 g 破壁及不破壁灵芝孢子粉,加入 500 m L水,分别采用超声振荡和回流法提取,过滤除去残渣。 上清液于 60℃ 水浴浓缩至 100 m L,加入无水乙醇 400 m L使乙醇体积分数为 80% ,沉淀出多糖。再用 80% 乙醇反复洗涤沉淀,于 60℃水浴烘干得灵芝孢子粉多糖{体育外围主词}。

  1. 3 灵芝孢子粉多糖质量分数测定: 多糖的质量分数采用苯酚 -硫酸分光光度法测定 [6 ]{体育外围主词}。

  1. 4 灵芝孢子粉多糖的 HPLC分析

  1. 4. 1 多糖的水解: 取 200 mg 灵芝孢子粉多糖,加入 2 mo l / L H2 SO4 38 m L加热回流 6 h,冷却,用饱和Ba( OH) 2 溶液中和至中性,过滤,清液浓缩定容至10 m L,进行 HPLC分析{体育外围主词}。

  1. 4. 2 HPLC条件: 色谱柱为 Kro masil N H2 ( 250m m× 4. 6 mm ) ,柱温 45℃ ; 流动相: 乙腈 -水 ( 80∶20); 体积流量: 1. 2 m L / min;示差折光检测器,恒温45℃ ; 进样量 20μL{体育外围主词}。

  1. 5 灵芝孢子粉多糖的 GC-M S分析

  1. 5. 1 多糖水解产物的乙?{体育外围主词}；?/span>: 取 1. 4. 1项水解后的灵芝孢子粉多糖,彻底蒸干其中水分,加入 70 mg 盐酸羟胺, 5 m L吡啶,于 90℃水浴加热 1 h;取出稍冷,加入 5 m L醋酸酐,再于90℃水浴加热 1 h;冷却, 加 10 m L水破坏醋酐,用氯仿萃取乙?；?/span>,氯仿萃取液用水洗涤,无水硫酸钠脱水,清液通氮气浓缩定容至 1 m L,进行 GC-M S分析。

  1. 5. 2 GC-M S条件: 色谱柱为 DB-1 ( 15 m× 0. 2mm , 0. 33μm)弹性石英毛细管柱 ,柱温初温 100℃ ,以 10℃ /min程序升温至 280℃ ,保持 10 min。载气He,柱前压 70 k Pa,分流比 10∶ 1,溶剂延迟 2 min,进样量 1. 0μL。 EI离子源,电子能量 70 eV ,四极杆温度 150℃ ,离子源温度 230℃ ,电子倍增器电压 2 300 V, GC-M S接口温度 280℃ ,质量扫描范围～ 500amu。

  1. 6 灵芝孢子粉多糖的 GPC分析

  1. 6. 1 GPC 条件: 色谱柱为 TSK-G EL G 3000 SW XL, 300 m m× 7. 8 m m,柱温 35℃ ; 流动相: 0. 05 mo l / L Na H2 PO4 -N a2 HPO4 缓冲液 ( pH= 6. 7, 加0. 05% NaN3 ) ;体积流量: 0. 5 m L /min; 示差折光检测器,恒温 35℃ ; 进样量 20μL。

  1. 6. 2 GPC校正曲线的建立: 取已知相对分子质量为 738、 5 800、 1. 22× 104、 2. 37× 104、 4. 8× 104、1. 0× 105{体育外围主词}、 1. 86× 105、 3. 8× 105{体育外围主词}、 8. 35× 105 的多糖标样, 用 0. 05 mol / L Na H2 PO4 -Na2 HPO4  缓冲液( p H 6. 7,加 0. 05% NaN3 )溶解,经 0. 45μm 滤膜滤过,进行 GPC分析。 以多糖标样的保留时间为横坐标,多糖相对分子质量的对数为纵坐标作 GPC的普适校正曲线。

  1. 6. 3 样品分析: 取一定量灵芝孢子粉多糖样品, 用 0. 05 mol / L Na H2 PO4 -N a2 HPO4 缓冲液 ( pH= 6. 7,加 0. 05% NaN3 )溶解,经 0. 45μm 滤膜滤过,进行GPC分析。根据样品的出峰时间在校正曲线上求得多糖峰的平均相对分子质量及其分布。

  1 结果与讨论

  1. 1 多糖的得率和质量分数: 考察了用不同方法提取灵芝孢子粉多糖的情况,不同提取方法的多糖得 率见表 1。 实验表明,回流法提取的灵芝孢子粉多糖得率最高。而无论何种提取方法 ,破壁与不破壁孢子粉的多糖得率比值基本恒定在 1. 69左右,说明不破壁孢子粉中的多糖中有一部分位于细胞内部,无论 何种方法都无法溶出; 而破壁后灵芝孢子粉的多糖可溶出,量显著增加。因此破壁灵芝孢子粉功效确实好于不破壁的灵芝孢子粉{体育外围主词}。 用不同方法提取得到的灵芝孢子粉多糖的质量分数在 65% ～ 75% {体育外围主词}。

  2. 2 灵芝孢子粉多糖的组成分析

  2. 2. 1 HPLC分析: 灵芝孢子粉多糖水解后用 HPLC 分析其单糖组成 ,并与单糖标样进行对照。 结果表明, 灵芝孢子粉多糖可能由葡萄糖和甘露糖组成,破壁灵芝孢子粉和不破壁灵芝孢子粉多糖组成相同。

  2. 2. 2 GC-M S分析: 灵芝孢子粉多糖水解并乙?；笥?nbsp;GC-M S分析其单糖组成 , 将单糖标样同时乙?；卸哉?。结果表明 ,灵芝孢子粉多糖主要是由鼠李糖{体育外围主词}、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖组成的杂多糖{体育外围主词}。 破壁灵芝孢子粉和不破壁灵芝孢子粉多糖的组成完全相同,只是相对量略有区别{体育外围主词}。

  2. 3 灵芝孢子粉多糖的相对分子质量及其分布: 破壁灵芝孢子粉和不破壁灵芝孢子粉多糖的凝胶色谱 见图1{体育外围主词}。多糖是由一个个单糖基连接而成的天然大分子化合物。用高效液相色谱法分析多糖 ,需要将多糖水解成单糖后进行; 而气相色谱或气相色谱 /质谱法除了要将多糖水解成单糖外,还需要将单糖衍生成 易气化的物质再进行分析。 这两种方法都破坏了多糖的原有结构 ,它们只分析多糖中单糖基的组成。凝胶色谱法根据大分子化合物的体积及相对分子质量 的大小进行分离,可以不破坏大分子化合物的原有 结构和性质直接进行分析,因此最适合分析多糖。在凝胶色谱中相对分子质量大的先出峰,相对分子质 量小的后出峰。 凝胶色谱图的每个峰都反映了大分子化合物的相对分子质量分布,通过已知相对分子 质量的多糖标样所作的普适校正曲线求得相对分子 质量。可见,破壁灵芝孢子粉多糖在 12. 3及 18. 0min处有两个多糖峰,而不破壁灵芝孢子粉多糖只有12. 3 min一个峰{体育外围主词}。 由多糖的校正曲线可以得到 , 12. 3min多糖峰的数均相对分子质量为 7. 80× 104 ,重均相对分子质量为 2. 91× 105 ,分布宽为 3. 74; 18. 0 min多糖峰的数均相对分子质量为 1. 17× 104 ,重均相对分子。

  质量为2. 71× 104 ,分布宽为2. 32{体育外围主词}。因此 ,破壁后灵芝孢子粉多糖得率增加的部分主要是相对分子质量较低的 多糖。 一般认为相对分子质量较小的多糖其生物活性较强,药用价值也较好,因此破壁灵芝孢子粉功效好于 不破壁的灵芝孢子粉{体育外围主词}。

  3. 结论

  不同提取方法所得灵芝孢子粉多糖的得率不同,破壁后灵芝孢子粉的多糖量增加 1. 69倍,增加部分主要是相对分子质量较低的多糖; 灵芝孢子粉多糖主要是由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和 半乳糖组成的杂多糖,破壁与不破壁的多糖组成完 全相同;破壁灵芝孢子粉多糖主要有两个多糖峰,数 均相对分子质量分别为 7. 80× 104 和 1. 17× 104 ,而

  不破壁灵芝孢子粉多糖只有相对分子质量为 7. 80×104 的一个峰。 这些分析结果表明,破壁灵芝孢子粉的功效应好于不破壁灵芝孢子粉。